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EMCS及其水溶性类似物Sulfo-EMCS是含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯和马来酰亚胺基团的异双功能交联剂，能够使含胺和巯基的分子共价交联。NHS-酯与pH7～9缓冲液中的伯氨基(-NH2)有效反应形成稳定的酰胺键，而马来酰亚胺与pH6.5～7.5的巯基反应形成稳定的硫醚键。在水溶液中，NHS酯的水解是该反应的竞争反应，速率随pH升高而加快。马来酰亚胺基团比NHS-酯基团更稳定，但在pH值> 7.5时，也会缓慢水解并失去对巯基的反应特异性。因此这些交联剂的共轭实验通常在pH7.2～7.5下进行，其中NHS-酯(胺基靶向)反应在马来酰亚胺(巯基靶向)反应之前或同时进行。

EMCS和Sulfo-EMCS通常用于在两步反应法中制备抗体-酶和半抗原-载体蛋白的共轭物。首先，将含胺蛋白质与数倍摩尔过量的交联剂反应，然后通过脱盐或透析除去过量(未反应)的试剂，然后加入含巯基的分子与已经连接到第一种蛋白质上的马来酰亚胺基团反应，形成目标共轭物。

Sulfo-EMCS可溶于水和许多其他水相缓冲液，最大约10mM，但溶解度会随着盐浓度的增加而降低。EMCS不能直接溶于水，必须先溶解在有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入水相反应缓冲液中稀释，有机溶剂的最终浓度若小于10%，则大多数蛋白质反应物能保持溶解状态。

名称	EMCS	Sulfo-EMCS
货号	GS4334	GS4352
中文名称	6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯	6-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯
英文名称	N-[-maleimidocaproyloxy]succinimide ester	N-[-maleimidocaproyloxy]sulfosuccinimide ester
CAS号	55750-63-5	103848-61-9
分子量	308.29	410.33
水溶性	不溶于水	溶于水
结构式
间隔臂	9.4 Å
纯度	＞95% on TLC

• EMCS和Sulfo-EMCS交联剂对湿度敏感在规定温度下干燥保存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须平衡到室温。
  实验前溶解所需量，并在水解发生前立即使用，不要制备储存液，丢弃任何未使用的重构试剂。
  
• 避免在共轭过程中使用含有伯胺和巯基的缓冲液，因为它们会与预期的反应竞争。如有必要，将样品透析或脱盐，转换为合适的缓冲液，如磷酸盐缓冲液(PBS)。
  
• 与马来酰亚胺部分反应的分子必须具有游离的(还原的)巯基。可以用固定的TCEP二硫化物还原肽二硫键。使用5 mMTCEP在室温下还原高分子量蛋白质中的二硫键，30min，然后用脱盐柱去除TCEP。请注意，蛋白质(例如抗体)可能因二硫键的完全还原而失活。选择性还原IgG铰链区中二硫键的可以用2-巯基乙胺·HCl完成。可以使用N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯或2-亚氨基硫烷·HCl将巯基加成到蛋白分子中，修饰伯胺。

• 材料准备：
  
  • 共轭缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)或pH6.5～7.5的其他无胺和无巯基的缓冲液，加入1～5mM EDTA有助于螯合二价金属，从而防止含巯基的蛋白质形成二硫化物。
    
  • 脱盐柱处理，去除过量的交联剂和反应副产物。
    
  • 需要结合的含胺的蛋白质(Protein-NH2)和含巯基的蛋白质(Protein-SH)。
• 操作步骤：
  
  • 将蛋白质-NH2溶解在0.1mM的共轭缓冲液中(例如50kDa的蛋白质，5mg溶解在1mL中)。
    
  • 将1mM(10倍摩尔过量)终浓度的交联剂加入到溶解的蛋白质-NH2中：
    
    • 对于Sulfo-EMCS，加入0.410mg到每ml蛋白质-NH2溶液种或溶解4.10mg Sulfo-EMCS于1mL共轭缓冲液中(制备10mM临时储备液)，并立即加入100μL/ml的Protein-NH2溶液中。
      
    • 对于EMCS，将3.08mg EMCS溶解在1mL DMSO(10mM)中，然后加入100μL/ml的Protein-NH2溶液中。
  • 室温或4℃下孵育30分钟。
    
  • 用共轭缓冲液平衡的脱盐柱，去除过量的交联剂。
    
    • 按照脱盐柱的产品说明书确定哪些馏分含有蛋白质-NH2。或者测量不同级分在280nm处的紫外峰值来定位蛋白质，但请注意，NHS-酯基团也在280nm处有强烈吸收。
  • 将蛋白质-SH和脱盐处理后的组合蛋白质-NH2混合，其摩尔比对应于最终缀合物所需的摩尔比，并与两种蛋白质上存在的巯基和活化胺的相对数量一致。
    
  • 室温孵育30分钟或4℃孵育2小时。
    
    • 一般来说，尽管反应通常在规定的时间内完成，反应进行数小时或过夜没有任何危害。在共轭反应完成前停止，可以加入浓度比蛋白质-SH的巯基高几倍的含有还原半胱氨酸的缓冲液。
      
    • 通过电泳和随后的蛋白质染色可以估计结合效率。